近年来，越来越多国内厂家推出基于免疫散射比浊法的特定蛋白检测产品，特别是在炎症标志物如C反应蛋白（CRP）、血清淀粉样蛋白A（SAA）检测方面，免疫散射比浊法已成主流。从技术层面上来说，免疫散射比浊法与免疫透射比浊法相比究竟有何优势？

2021年6月，《中华内科杂志》发表的《糖尿病肾脏疾病早期预测与诊断专家共识》^[1]提到，在尿白蛋白定量检测方法中，免疫散射比浊法灵敏度和特异性均较高，线性范围广，但是需要特种蛋白分析仪；免疫透射比浊法操作简单，多数实验室可开展，但是其灵敏度和特异性不如免疫散射比浊法（图1）。

图1 《糖尿病肾脏疾病早期预测与诊断专家共识》截图

1、灵敏度和测量范围

表1对比了深圳市国赛生物技术有限公司（下称“国赛生物”）Aristo（2015年推出）与罗氏cobas6000部分特定蛋白项目^[2]的测量范围。

在所统计的23个特定蛋白项目中，国赛生物有14个项目的检测范围下限等于或低于罗氏，其余19个项目的检测范围上限等于或高于罗氏。可见，国赛生物Aristo特定蛋白分析仪基于免疫散射比浊法检测原理，其特定蛋白项目检测灵敏度和检测范围整体上较免疫透射比浊法更有优势。

表1 罗氏cobas6000与国赛生物Aristo特定蛋白项目测量范围对比

2、精密度

段玉东等^[3]关于散射比浊法和透射比浊法测定血浆免疫蛋白的比较研究中，对比了奥林巴斯AU640全自动生化仪和贝克曼IMMAGE 800检测IgA、IgG、IgM和C3、C4的批间精密度和批内精密度。结果显示，散射比浊法的批内精密度和批间精密度明显优于透射比浊法，但准确度方面无显著差异。

李若林等^[4]对比研究了透射免疫比浊法和胶乳增强散射比浊法检测不同浓度的ASO、C4的定量结果。结果表明，胶乳增强散射免疫比浊法检测重复性（CV均＜2%）比透射免疫比浊法（CV均＞3%）较好。文中对可能的原因分析如下：

（1）两种检测方法的原理（图2）不同

免疫散射比浊法是采用特定波长的光水平照射，通过溶液时遇到抗原-抗体复合物颗粒，光线发生折射偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原-抗体复合物颗粒的大小和多少相关。免疫透射比浊法的基本原理是测定一定体积的溶液通过的光线量(即光通量)。当光线通过时，由于溶液中存在抗原-抗体复合物颗粒对光线的反射和吸收引起透射光的减少，测定的光通量与抗原-抗体复合物多少呈反比。

图2 散射比浊法和透射比浊法光路的不同

（2）两种方法的检测线性范围存在差别

免疫散射比浊法所用光源的波长较短，光谱范围广，散射夹角较大，能检测到较大范围内的散射光。利用胶乳颗粒联接抗体或抗原的技术还可进一步提高试剂的检测灵敏度和检测范围。免疫透射比浊法测量的是入射光，要求抗原-抗体形成的免疫复合物达到一定的数量，分子颗粒大小较大才能精确测定，故敏感度相对较低。

（3）免疫散射比浊分析仪器有自动稀释和自动重检功能。透射比浊法测定高值C4浓度，若发生抗原过量，检测结果会显著低于真实值。而散射免疫比浊分析仪，会提示应将待测样本进一步稀释重测，从而获取全部抗原的真实浓度。

此外，检测精密度与试剂原料有密切关系，特别是胶乳微球。在试剂研发和生产过程中，选用尺寸高度均一、粒径合适的高品质胶乳微球（图3），有助于提升检测试剂的精密度、重复性。

 图3 国赛生物200nm胶乳微球扫描电子显微镜（SEM）照片

3、抗干扰能力

常见的溶血、脂血、黄疸等因素以及类风湿因子（Rheumatoid factor，RF）等自身抗体、M蛋白、嗜异性抗体等均容易对免疫透射比浊法产生干扰，这些干扰因素可导致待测物的结果出现假性升高或降低。

贾珂珂等^[5]研究了常见干扰因素对于免疫比浊法的影响。当尿胆红素浓度为16.85μmol/L（相当于“1+”）时，对免疫透射比浊法的干扰率为22.94%，而对免疫散射比浊法的干扰率为15.11%。说明免疫散射比浊法相对于免疫透射比浊法的抗尿胆红素干扰能力更强。

此外，相对于免疫透射比浊法，免疫散射比浊法更不易受M蛋白干扰，其原因可能是免疫散射比浊法在检测前先对样本进行预稀释，从而降低了M蛋白的干扰。

RF也是目前常见的干扰免疫透射比浊法的内源性干扰物质。RF对免疫透射比浊法的干扰机制主要为RF与试剂2中包被抗体的胶乳颗粒发生非特异聚集，造成反应体系的浊度增加。有报道指出，RF可干扰Cys C、MMP-3等检测。

嗜异性抗体是由已知或未知抗原物质刺激人体而产生的一类具有足够滴度、能与多个物种的Ig发生相对弱结合的多重特异性Ig。免疫学检测试剂使用的抗体多为动物来源，嗜异性抗体可与多种动物Ig的Fc或Fab表位发生非特异性结合。在免疫透射比浊法试剂中，一般在试剂2中含有包被检测抗体的胶乳颗粒，嗜异性抗体可结合该检测抗体，发生聚集反应，引起浊度升高，对检测结果造成正干扰。

正确应用封闭剂、抗体定向偶联技术（Antibody Oriented Coating）和嗜异性抗体阻断剂（Heterophilic blocking reagent，HBR），可有效提高试剂灵敏度和抗干扰能力等性能。

封闭剂：可有效抑制蛋白质的非特异性吸附，提高胶乳微球及磁珠的胶体分散稳定性，以及偶联物的活性，获得信噪比（S/N比）更高的试剂（图4）。

                图4 封闭剂的作用

抗体定向偶联技术：利用羧基微球与抗体Fab片段以巯基偶联的方式实现定向偶联，形成抗体-微球复合物。该方法能够有效控制抗体与微球连接时的方向，实现定向偶联，充分保护抗原结合位点活性，减少空间位阻影响，从而提高胶乳试剂的灵敏度和对于类风湿因子(RF)等的抗干扰能力。

主动型阻断剂：能够特异性消除HAMA和RF等嗜异性抗体干扰，使用浓度低，阻断效果强。国赛生物选用高品质HBR主动阻断剂，有效阻断假阳性反应，提高试剂抗干扰能力，有效减少可能的假阳性或假阴性错误检测结果。而传统的被动阻断方法使用非特异性的物质（小鼠IgG、小鼠血清、非特异性单克隆抗体，聚合IgG等）来阻断人嗜异性抗体结合，阻断效果常不够理想。

4、抗原过剩检测和高值样本自动稀释重测

当待测物浓度过高时，免疫散射比浊法和免疫透射比浊法均可能出现检测结果假性降低。钩状效应是影响免疫比浊法检测准确性的一个重要因素。

杨杰等^[6对ASO、mALB、hs-CRP、β2-微球蛋白、RBP和Cys C分别用5种免疫透射比浊法试剂盒进行检测。结果显示，不同试剂盒的抗原过量安全范围差异很大，部分试剂盒受钩状效应影响严重。大部分透射比浊试剂盒未提供防范钩状效应的有效措施，还存在按厂家的带现象检查参数设置检测程序后仍不能防止带现象的情况。因此，实验室在选择试剂盒时，有必要对防范钩状效应性能进行验证，并结合测量程序优化报警参数。

对于透射比浊法，虽然部分中高端生化分析仪也宣称支持抗原过剩检测和自动稀释重测，但通常需要匹配原厂试剂测量程序，且只能以固定稀释倍数稀释样本，此时仍有发生抗原过量的风险。而市场上生化分析仪品牌、型号众多，质量性能参差不齐，许多医院使用的生化试剂为非原厂配套试剂，这些试剂大多缺失抗原过量方面的相关参数，从而限制了抗原过剩功能在透射比浊平台的应用。

国赛生物的Omlipo和Aristo全自动特定蛋白分析仪支持抗原过剩检测，结合超过检测范围时的样本自动重测功能，对一些容易出现抗原过剩的项目如尿微量白蛋白（mALB）、转铁蛋白（TRF）、免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白M（IgM）等，可以及时识别和处理，减少因抗原过量而导致检测结果错误低值的情况。

国赛生物Aristo抗原过剩检测具体过程如下：

首先，在预反应中，用全量试剂和部分样本进行反应。

如果超出定义限值的信号显著上升，仪器将使用设置的稀释度自动重测（前提是已设置自动重测功能），样本自动稀释后，仍执行一次预反应程序，若此时信号值仍超出定义限值，则报告抗原过剩报警（不报告具体数值）。

若预反应信号值未超过定义限值，则在预反应完成后，加入其余样本并进行后续反应。

5、不止于特定蛋白分析，更可灵活组成血液/尿液分析流水线

血常规作为检验三大常规之一，有非常重要的临床应用价值。血常规、C反应蛋白（CRP）和血清淀粉样蛋白A（SAA）一体机的应用，使门急诊同时检查血常规和CRP、SAA的标本检测更加便利，但普遍存在检测速度慢、检测成本高、检测范围窄（特别是SAA）等不足。因此，特定蛋白分析仪仍将会在临床检验工作中发挥着不可替代的作用。

目前部分采用免疫散射比浊法的特定蛋白分析仪可以与血液细胞分析仪联机（图5），在实现“一管血”“一次上样”检测血常规和CRP、SAA的同时，还能够保证更快的检测速度和更优异的CRP、SAA结果，达到检测质量和检验效率的平衡。

图5  国赛生物Aristo与Horiba YH1500/YH2500联机

除血常规外，尿常规也是临床实验室常规检查项目之一。尿干化学和尿液有形成分分析，对于判断尿路感染和肾脏损伤具有重要意义。

国赛生物Aristo系列可与尿常规分析组成尿液分析流水线（图6），实现“一管尿，全面检”，优化尿液样本检测流程，提高尿液样本检测效率。

图6 优利特US-300尿液分析流水线

随着检验科对仪器自动化程度要求的提高，特定蛋白分析仪与血液分析仪、尿液分析仪联机组成级联系统，甚至接入实验室自动化分析流水线，都将是特定蛋白分析的一个重要发展趋势。

【写在最后】

无论是免疫散射比浊法还是免疫透射比浊法，目前都在临床上得到普遍应用。在特定蛋白检测方面，免疫散射比浊法相较于免疫透射比浊法有着天然的方法学优势。但不同厂家的试剂性能仍存在相当大的差异，这是因为最终的试剂性能除与方法学有关外，还与试剂胶乳颗粒、抗体、抗干扰能力（阻断剂）、生产工艺、质量控制等因素有密切关系，同时还离不开仪器设备检测方法、设备稳定性、抗原过剩检测功能等。

用户在选择特定蛋白产品时，应综合考虑这些影响因素，选择知名度高，装机量大，检测方法学先进，仪器功能全面，试剂稳定可靠、性能优异的产品。

参考文献

[1]    张俊清, 苏白海, 张捷,等. 糖尿病肾脏疾病早期预测与诊断专家共识[J]. 中华内科杂志, 2021, 60(06):522-532.

[2]    彭凤. 免疫透射比浊测定技术的进展和分析特性[J]. 检验医学, 2012, 27(004):252-256.

[3]    段玉东, 桑俊军, 闫海鹏,等. 散射比浊法和透射比浊法测定血浆免疫蛋白的比较[J]. 中国医药导报, 2008, 005(002):87.

[4]    李若林, 邓雪莲, 徐明辉,等. 两种方法测定ASO，C4结果的可比性研究[J]. 国际检验医学杂志, 2010, 031(002):105-106.

[5]    贾珂珂, 孙文苑, 聂睿,等. 免疫透射比浊法常见干扰因素的识别与应对策略[J]. 检验医学, 36(4):7.

[6]    杨杰,李玲,张瀚允,张鹏,曾方银. 5种免疫透射比浊法试剂盒检测特定蛋白钩状效应的性能评估[J].国际检验医学杂志,2019,40(2):140-143.