实时荧光定量PCR技术具有巨大的优势：快速、灵敏度高、重复性好、污染风险低等优点而得到了广泛的应用。但常用的荧光PCR机器通常只有4-6个通道，基于水解探针的PCR的多重检测上限通常限于每个荧光通道对应一个靶标，极大地限制了多重检测的能力。新近出现的多重探针扩增（MPA）技术将TagMan探针技术和溶解曲线技术相结合，充分利用4个荧光通道（FAM、VIC、ROX、CY5），每个荧光通道分别检测多达6个不同的靶点，成功克服了荧光通道的限制，实现了单管检测多达20个以上靶基因。

MPA技术对每个特定靶点使用PCR引物和探针（双标记荧光探针和部分互补寡核苷酸杂交探针PCO）的组合。每个探针/PCO混合物都有一个独特的溶解曲线（不同的溶解温度），允许对样品中的目标进行特定检测。实时PCR以常规方式进行，指数扩增样品中的任何病毒或细菌靶标。如果存在一个或多个靶标，则在探针水解过程中消耗相应的探针，从而增加放大荧光信号并生成最终的溶解曲线。通过比较每个样品与阴性质控的溶解曲线，可以判定消耗了哪些特定探针；通过形成一个特征性的溶解曲线特征谱来提示样品中存在的靶标类型，见图1。

图1 MPA技术的双探针设计和特征性溶解曲线谱

目前MPA技术已成功用于多个领域，涉及妇女生殖健康、肿瘤、传染性疾病、基因测序等。

应用一：HPV检测

应用基于MPA技术开发的高风险人乳头状瘤病毒（HR-HPV）的实时PCR检测方法，可用于体外分型检测女性患者的宫颈脱落细胞中 HPV 病毒 DNA，包括13 种高危型HPV：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 和 68 型，以及 2 种中危型HPV：66、73。此技术的独特优势在于仅需单个PCR反应管，通过测定实时PCR中每个荧光通道中溶解曲线谱的差异分析多达六个靶标，以实现对15种中高危HPV类型的多重检测，见图2。全程闭管反应，减少开管污染风险，成本低、速度更快，无需特定的专用平台，广泛兼容PCR实验室中常用的96孔实时荧光PCR设备。目前此产品已相继获得CE和中国NMPA认证，并且拓展开发了国际领先的HPV mRNA15全分型试剂盒，可更好地区分HPV的一过性感染和持续性致癌感染。

图2 基于MPA的HR-HPV特异性探针的设计。

（A）设计用于靶向HR-HPV特定序列 45（+），51（+），35（+），66（+），56（+）和33（-）探针混合物的溶解曲线图谱。用ROX荧光团标记探针。

（B）设计用于靶向HR-HPV特定DNA序列的59（+），31（+），16（+），18（+）和52（-）探针混合物的溶解曲线图谱。用FAM荧光团标记探针。

应用二、呼吸道病原体多重检测

引起呼吸道感染的常见病原体多达20-30种，基于MPA技术开发呼吸道病毒联检（RVP）及呼吸道细菌联检（RBP），RVP+RBP联合检测模式时，可同时检测新型冠状病毒及其他32种呼吸道感染病原体，基本涵盖临床上常见的呼吸道感染病原体。单独检测模式时，可根据流行季节和发病情况选择单管(RVP)检测新型冠状病毒和其他17种常见呼吸道感染病毒(包括非典型病原体)，用以区分新型冠状病毒与其他冠状病毒及其他呼吸道感染常见病毒,快速区分和鉴别其他症状相似的非新型冠状病毒感染;或选择单管(RBP)检测15种常见呼吸道感染细菌(包括非典型病原体)，全面筛查我国社区获得性肺炎的常见流行菌种，特别是高效应对各种复杂的多病原体合并感染。