血糖检测是评估糖代谢的一种重要手段，在临床生化检验中不可或缺，也是医学检验教学中必须开展的实验内容。己糖激酶（HK）法是WHO推荐的测定血糖的参考方法，但该法所需的试剂昂贵、实验条件要求严格，在常规实验教学中难以推广。相比之下，葡萄糖氧化酶－过氧化物酶(GOD-POD)法操作简单，试剂商品化、价格低，线性范围、重复性、呈色稳定性及特异性等均能满足临床一般要求，与HK法相关性良好，故广泛应用于临床生化检验的实验教学^[1]。但是，在笔者的临床生化实验课中，进行血糖GOD-POD法实验时发现该法存在一些不足，并提出问题：（1）GOD-POD法中所使用的紫外-可见分光光度计操作繁琐、费时，能否采用操作更为快捷简便的酶标仪代替；（2）温浴时间的波动是否会影响血糖测定的准确性。因此，基于第一个问题，笔者使用紫外-可见分光光度计和酶标仪不同浓度葡萄糖溶液GOD-POD测定，绘制两者的线性相关方程并加以对比；基于第二个问题，笔者设置不同温浴时间的血糖GOD-POD测定实验，对比不同温浴时间对血糖检测结果的影响。

2.1实验原理

GOD-POD法即葡萄糖氧化酶法，可以用来测测定血清（(浆)葡萄糖。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOD)利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase，POD)在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醒类化合物，即Trinder反应。

红色酮类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。

图 1 GOD-POD实验原理

2.2材料与仪器

2.1.1 器材 紫外-可见分光光度计、酶标仪

2.1.2 试剂 GOD-POD试剂盒、标准血清样品、葡萄糖标准液、低浓度血糖标本（血清，浓度为3.25mmol/L）、中浓度血糖标本（血清，浓度为5.17mmol/L）、高浓度血糖标本（血清,浓度为16.10mmol/L）

2.3方法

2.2.1紫外分光光度计与酶标仪的标准曲线

将标准葡萄糖溶液用蒸馏水作系列稀释，分别为8mmol/L、16mmol/L、24mmol/L、32mmol/L、40mmol/L。每个浓度的葡萄糖溶液采用GOD-POD法进行反应后，使用两种仪器测定反应结果。

紫外可见分光光度计：以空白试剂调零，在505nm处用测定不同溶液的溶液吸光度，绘制得线性相关方程。

酶标仪：将空白试剂与不同浓度溶液分别加入未做处理的酶标板微孔内，在492nm处测定吸光度，绘制得线性相关方程。

2.2.2葡萄糖氧化酶-过氧化酶法不同温浴时间的比较

采用GOD-POD法进行血糖浓度的测定，设置个温浴时间，分别为5min、10min、15min、20min、30min，将每个温浴时间均设置一个反应管。所有反应管均在37℃的恒温水浴箱中进行温浴，到达相应的温浴时间即进行吸光度的测定。

为了保证实验结果的可靠性，本实验采用低浓度标本、中浓度标本和高浓度标本进行上述实验。

3.1紫外与酶标仪的标准曲线对比 

以浓度为横坐标, 吸光度值为纵坐标, 进行线性回归得紫外与酶标仪的标准曲线（见图1）。酶标仪（100μ/孔）所得的线性范围与分光光度计相同，均为0mmol/L~32mmol/L，但紫外的标准曲线的斜率明显高于酶标仪, 说明紫外的吸光度值对浓度的敏感程度高于酶标仪, 即在测量浓度差别很小的不同样品时, 紫外所得数据的差别较酶标仪更明显。酶标仪（200μ/孔）所得的线性范围为0mmol/L~24mmol/L，小于酶标仪（100μ/孔）和紫外的线性范围。酶标仪（200μ/孔）的标准曲线的斜率高于酶标仪（100μ/孔），但仍小于紫外，说明酶标仪（200μ/孔）的吸光度值对浓度的敏感程度高于酶标仪（100μ/孔），但与紫外相比，对浓度变化敏感度不足。

图 2 紫外与酶标仪的标准曲线对比

3.2不同温浴时间的影响

前20min，高浓度、中浓度和低浓度血糖样本均有明显的变化；在15min~20min，低浓度血糖样本的吸光度值趋于稳定，中浓度血糖样本略有下降趋势，高浓度血糖样本的下降趋势比中浓度血糖更明显(见图1)。低浓度血糖样本的前20min的相对误差均大于5％，仅在30min时的相对误差较小；而中浓度血糖在5min和30min时相对误差均较小；高浓度血糖的相对误差均小于5％，其中，在15~30min时内小于0.5％，说明和理论值相近（见表1）。

综上所述，对于低浓度血糖样本而言，温浴时间在20min~30min里吸光值趋于稳定，相对误差也逐渐变小，因此在30min时测量吸光值较准确；对于中浓度血糖样本，温浴时间在20min~30min时，吸光值虽然略有降低，但降低幅度较小，相对误差也较小，结果较为准确；而对于高浓度葡萄糖来说，吸光值在15-30min降低幅度较大，但相对误差均小于0.5％，所以选择在温浴30min后测量吸光值。

3.2 不同浓度血糖的影响

前15min内，三个不同浓度的血糖进行对比，均是高浓度血糖样本的变异系数和相对误差最小；在20min时，低浓度血糖的变异系数最小，但相对误差却大于15％；在30min时，中浓度血糖的变异系数最小，高浓度血糖的相对误差最小，为0.3％。（见表1）综合分析，在前30min内，高浓度血糖样本的测量结果准确度最高。

紫外可见光分光光度计和酶标仪是临床生化实验中常用的分析测量工具，紫外分光光度计的优点是：

（1）检测波长范围较宽

（2）加样量不一致对检测结果没有影响

缺点是：

（1）样品用量大

（2）检测速度慢、效率低、实验时间较长

酶标仪的优点是

（1）样品用量少，几微升的样品即可检测

（2）速度快、效率高，可以提高实验课程效率

缺点是

（1）酶标仪操作要求高，必须保证每个孔加样量严格一致，才能保证结果的准确性

（2）为了减少测量误差，应尽量避免在300nm以下使用酶标仪含量测定^[2]。

本实验中，对比酶标仪和紫外分光度计的GOD-POD法的标准曲线发现，两种方法的线性范围均满足血糖GOD-POD法的实验要求，但是紫外可见分光光度计的标准曲线斜率明显高于酶标仪，说明在紫外光区紫外可见分光光度计对浓度的敏感程度高于酶标仪，即在测量浓度差别较小时，紫外所得数据的差异较酶标仪更明显。但是，与紫外可见分光光度计相比，酶标仪操作更为简单，样品检测效率高，适合大规模的实验教学^[3,4]。

GOD-POD法测葡萄糖中葡萄糖氧化酶和过氧化物酶在37℃活性最大，温浴可以降低反应活化能，提高反应速率。由于在日常的教学实验课过程中发现分光光度计数量有限，与实验人数不匹配，很难保证在要求的5min的温浴时间后可以立即进行分光光度计检测，因此我们想要探究不同温浴时间对血糖吸光度的影响。

在相同浓度的血糖下，不同温浴时间测得的血糖浓度不同，变异系数和相对误差也要有变化，在低中高浓度下，随着温浴时间的延长，由吸光值的变化程度可以看出，反应逐渐稳定，结合变异系数和相对误差，在30min时测量最为准确；在相同温浴时间下测得的不同浓度血糖的准确度和精确度不同，由变异系数和相对误差可看出，高浓度血糖的测量结果在前30min准确度最高。

综上所述，紫外与酶标仪都可以用于物质含量测定，我们将继续对两种仪器检测的精密度、重复性、平均加样回收率进行深入探究，以明确两者在临床生化实验教学中的优缺点。在不同温浴时间的实验探究发现，温浴时间为30min时，不同浓度血糖的GOD-POD法检测结果准确度最高。

[1] 朱传江,刘苹.葡萄糖氧化酶-过氧化物酶改良法的建立——血糖测定时间窗口的探讨[J].中国药理学通报,2010,26(09):1246-1249.

[2]范鹏, 蒋林东, 王小丹,等. 紫外分光光度计与酶标仪测定盐酸川芎嗪含量的比较[J]. 西南国防医药, 2010(07):720-722.

[3]肖婷,刘守柱,薛超彬,罗万春.紫外分光光度计法与酶标仪微量法测定酚氧化酶蛋白含量及活力的比较[J].昆虫知识,2008(02):306-309.

[4]杨帆,李淑梅,杨晓,牛杰.分光光度法与酶标仪微量法测量菌液浓度的比较[J].光谱实验室,2011,28(04):1752-1754.