转录组测序技术（RNA-seq）作为目前二代测序领域最普遍的技术手段而获得广泛应用，应运而生的多种方法各有特点、争奇斗艳。传统方法通常需要富集mRAN，片段化mRNA，反转录和加接头，及扩增等。缺点是只能每个样品独立建库，获得的全长转录组信息中绝大多信息在后期分析中极少用到，普遍存在建库步骤多、耗时长、效率低、测序深度不够、成本高等问题；如果成百上千的样品需要测序，例如目前历程研究经常必须进行的成千上万样品的大规模队列研究，则效率十分低下。

针对以上问题，南方医科大学潘星华教授团队联合广州序科码生物技术有限责任公司创新开发的以mRNA 3’端序列构建文库的MustSeq（Multiplexible, Universal, Strand specific, Transcriptome Sequencing）技术在建库效率、建库成本、测序成本等方面都取得显著的进步。同时，RNA Biology杂志在线发表的“MustSeq, an alternative approach for multiplexible strand-specific 3’end sequencing of mRNA transcriptome confers high efficiency and practicality”一文中对该项技术应用在细胞水平、动物模型中的多种性能表现做了详细验证，并获得高质量的满意结果，与国际国内现行方法比较具有明显的优势。

MustSeq是一种用于3’端mRNA文库构建和分析的快捷方法,其主要是使用独特的Oligo-dT引物对mRNA逆转录并仅进行一轮PCR扩增快速完成文库的构建。MustSeq 在相关性系数，基因、功能元件以及通路富集的检出率等方面，对比同类3’端mRNA-seq技术，能以数量级更低的测序深度获得更加接近传统的全长mRNA-seq测序结果。具有更加高效，稳定，快捷和节约成本的优势。

其原因在于，MustSeq是用反转录（RT）引物捕获mRNA的3’端，该引物由Oligo-dT、Barcode、UMI和Illumina- compatible 5’adaptor组成。在逆转录过程中，Oligo-dT作为引物来捕获mRNA转录本的3’poly-A尾。因此，可用total RNA作为输入材料，不需要额外去除rRNA的步骤。并且改变了传统UMI设计形式，将一般NNN改为（NBB）n的形式(N = 任意核苷酸，B = 除A外的寡核苷酸T、C或G)，以避免形成引物二聚体，并便于鉴定，从而提高了反转录效率和差异基因表达（DGE）分析的准确性。其独立设计的一步扩增法，不需要预先打断mRNA, 也不需要在mRNA的5’末端连接接头或进行非模板依赖性的核酸延伸。另外，在反应的第一步反转录时就引入样品barcode标记，从而在实验程序的早期就把数十至数百个样品混合（pooling），随后如同单个样品一样进行一步扩增法，完成RNA-seq文库的构建，这种设计大大减少了样本处理的工作量、偏差、成本，同时提高了速度和效率。

图1. Must-seq文库构建技术流程图（L. Mai et al. RNA Biol 2021）

该技术称为Must-seq,以RNA-seq为基础开发但是大大精简，只获得必要（Must)的序列信息而从一开始就排除非不要、冗余信息，适用于以差异基因表达（DGE）分析为主要方向的大规模样品转录组研究。可用有效解决临床大队列研究中的肿瘤、炎症、遗传病及发育、衰老等相关疾病的基因调控甚至筛查和检测等相关问题。

值得一提的是，本技术在论文基础上的进一步拓展在检测石蜡包埋的RNA部分降解样品（FFPE）的基因特征方面具有独特优势，无论对全转录组还是特定的一组基因拼盆可以自由选择，特别是对肿瘤和遗传病的融合基因的检测也大大革新了目前最先进的检测技术。

基于临床检测需求与精准医学发展，在肿瘤基因检测中，过去对融合基因的检测多用DNA-NGS。然而多项研究表明，DNA-NGS在检测融合时会存在内含子过长、重复序列多、低质量样本不灵敏、基因组复杂等问题而导致漏检，不能准确地指导靶向用药。而RNA-NGS是在RNA水平上检测融合基因，由于成熟mRNA中不存在内含子区域，从而避免了DNA-NGS存在的缺陷问题。所以，多个权威的肿瘤指南/共识更推荐RNA-NGS用于融合基因检测，以弥补DNA-NGS造成的融合基因漏检缺陷。

图2. DNA作为模板检测基因融合/重排，易位以及跳读等结构变异主要存在4类局限（K. D. Davies et al. Clin Cancer Res 2019）

近年来多种检测融合基因的RNA-NGS技术被开发出来，但大多存在样本质量耐受度低、成本高、操作复杂等缺点。因此，南方医科大学与广州序科码生物技术有限责任公司，在MustSeq技术的基础上，开发的一种用于多个肿瘤相关融合基因检测，克服了上述缺点，为临床提供一种更加高效，快捷的融合基因检测方式。

MustSeq的价值在于对大样本量有效地应用中通量和高通量分析来解决实际的科学问题。该技术不仅提高了RNA测序的效率，也为以DEG为主要方向的转录组研究提供了一种有效的选择。在全转录组还是有限基因拼盆的基因表达差异检测、RNA水平的融合基因检测、石蜡包埋样品的基因表达检测等诸多方面都有独特的优势。预期MustSeq技术在医学检验领域将发挥重要的作用。